Provoz parazitologické laboratoře pro diagnostiku Trichinella spp. ve Státním veterinárním ústavu Praha
Vyšetřování svaloviny domácích a divokých prasat, případně i jiných druhů zvířat (koní, jezevců, srnčí, jelení, daňčí a mufloní zvěře) na přítomnost larev Trichinella spp. provádí v souladu s Nařízeními Komise Evropských Společenství (č.2075/2005 a č.1245/2007) a podle ČSN EN ISO/IEC 17025:2005 od 15.června 2008 ve Státním veterinárním ústavu Praha speciální akreditovaná parazitologická laboratoř. Cílem tohoto příspěvku je informovat o její dosavadní činnosti. Obsahem sdělení jsou dále výsledky porovnání záchytnosti larev trichinel při použití kompresní a trávicí metody a uvedení nového modifikovaného postupu přípravy svaloviny k vyšetření pomocí kompresoria.
Čtenáři časopisu Myslivost byli v průběhu posledních deseti let dostatečně seznamováni s problematikou trichinelózy. Byli informováni o druhovém spektru a biologii původců této závažné parazitózy přenosné na člověka a ohrožující nejen jeho zdraví, ale dokonce i život, aktuálních nálezech parazita na území České republiky i v sousedních státech. Protože však doposud nebyla myslivecká veřejnost blíže informována o praktické činnosti diagnostické trichinoskopické laboratoře rozhodli jsme se její náplň na příkladu naší laboratoře v tomto příspěvku popsat. Přáli bychom si, aby sdělení přispělo také ke vzájemnému porozumění mezi pracovníky laboratoře a lovci tím, že představíme kompletní postup počínaje příjmem vzorků, metodě jejich vyšetření, současných formách plateb, způsobech předávání výsledků, vedení administrativy apod., kterou musí se vším všudy akreditovaná laboratoř přísně dodržovat a že tedy není možné výsledek vyšetření předat do pěti minut.
Pozitivní hlášený nález Trichinella spp. ve druhé polovině prosince 2010 a další dva ze stejné lokality v lednu 2011 u divokých prasat na Orlickoústecku, podrobně popsané ve třetím čísle časopisu Myslivost (str. 46 - 48, 2011) Koudelou a kol., ještě více podtrhují význam důsledného vyšetřování. Lovci černé zvěře jsou si toho velmi dobře vědomi, což se projevilo také v naší laboratoři nárůstem počtu přijímaných vzorků.
Parazitologická laboratoř v SVÚ Praha prováděla až do konce října 2001 pouze vyšetřování svaloviny divokých prasat, a sice do té doby rutinní kompresní metodou (viz dále) stejně jako v laboratořích jatek u domácích prasat. Na základě Vyhlášky Ministerstva zemědělství ČR (č.400/2001) používáme od listopadu 2001 trávicí metodu. Podle ISO/IEC 17025:20205 byla laboratoř dne 20. 5. 2006 akreditována, čímž splnila nejen požadavky SVS ČR, ale i různá Nařízení Komise Evropské unie pro úřední kontrolu trichinel v mase vnímavých zvířat.
Od roku 2003 jsme začali vyšetřovat také svalovinu domácích prasat ze tří provozů Berounska. Na základě požadavku Krajské veterinární správy pro Plzeňský kraj - zabezpečit trichinoskopické vyšetření ze 6 jatek, s plánovaným počtem porážek až 1200 ks denně, bylo rozhodnuto zřídit v oddělení patologie a parazitologie speciální laboratoř pro diagnostiku Trichinella spp. (obr. 1). Její činnost byla zahájena 15. června 2008. Pracoviště bylo vybaveno novou přístrojovou technikou, laboratorními pomůckami a kompletním provozním zázemím tak, aby odpovídalo všem požadavkům akreditace. Bylo posíleno také personálně a pracuje ve dvousměnném provozu. V současné době je týdně vyšetřeno v průměru 8 až 10 tisíc vzorků svaloviny domácích prasat a v období lovecké sezóny denně 250 – 420 divočáků. Přehled o počtech vyšetřených zvířat v období let 2003 až 2010 uvádíme v tabulce 1. Na našem pracovišti doposud nebyl zjištěn pozitivní nález Trichinella spp..
Příjem vzorků
Dovoz vzorků svaloviny domácích (ze 43 jatek) a divokých prasat, případně koní a jiných volně žijících zvířat, je z inspektorátů Krajských veterinárních správ Jihočeského, Karlovarského, Královéhradeckého, Libereckého, Plzeňského, Středočeského a Ústeckého kraje, dále z Městské veterinární správy v Praze zajištěn tzv. svoznými linkami SVÚ Praha. Automobily vybavené chladícími agregáty přivážejí mezi 16.00 – 20.30 hod. k vyšetření také materiál určený ostatním laboratořím ústavu z jednotlivých sběrných míst podle denního „jízdního řádu“. Speciální „trichinelózní linka“ zajišťuje odvoz vzorků z Plzeňska. K trichinoskopickému vyšetření si přinášejí svalovinu v některých případech lovci osobně. Typy obalů, ve kterých jsou dodávány vzorky do laboratoře jsou na obr. 2.
Ke každému vzorku či sérii musí být přiložena speciální žádanka k vyšetření a v ní vyplněny všechny údaje v kolonkách nutné k registraci v programu tzv. LABSYSTEM. Formulář „Objednávka laboratorního vyšetření na svalovce u volně žijící zvěře (vzor č.7)“ je pro lovce k dispozici na internetových stránkách SVÚ Praha v záložce „Objednávka“. Žádanku je třeba vkládat odděleně od uzavíratelného obalu se vzorkem svaloviny.
Metody vyšetřování
K získání objektivních výsledků vyšetření je velmi důležitý již vlastní odběr vzorků. Vhodnost výběru typu svaloviny podle preference larev různých genotypů Trichinella spp. (opouzdřené, neopouzdřené) zjišťovali v posledním období např. Kapel, C.M.O. a kol. (2005). Na sérii experimentálních infekcí domácích a divokých prasat, lišek a koní sice postmortálně prokázali v období od 5 – 40 týdnů po nákaze u jednotlivých druhů trichinel a hostitelů určité odlišnosti nejčastější lokalizace parazita, avšak z jejich výsledků lze vyvodit závěr, že zejména bránice, svaly žvýkací a končetin a jazyk jsou skutečně nejvhodnější k vyšetření na přítomnost larev Trichinella spp.. Je to tedy v souladu i s našimi metodikami týkající se odběrů vzorků masa k úřední kontrole jeho nezávadnosti. K diagnostice svalovce se používají následující metody.
Kompresní metoda
Hlavním impulzem k vyšetřování zejména vepřového masa byly epidemie trichinelózy doprovázené onemocněními označované jako „otravy šunkou“ a úmrtími lidí v některých oblastech Německa v období let 1863 až 1865. Již v roce 1863 se začala svalovina prasat vyšetřovat stlačením mezi dvě silná skla a Rudolf Wirchow v roce 1866 obhajoval zřízení Institutu státního dozoru pro kontrolu porážených prasat.
Laboratorní pomůcka se po roce 1863 postupně zdokonalovala do podoby, kterou dnes označujeme jako kompresorium. Stejně tak jako před téměř 150 lety je principem kompresní metody vyšetření nastříhaných kousků svaloviny velikosti obilního zrna stlačením upevňovacími šrouby ve 28 políčcích kompresoria (obr. 3, 4). Tímto způsobem se vyšetřuje asi 1 gram svaloviny.
Prohlížení vzorků je časově poměrně náročné. K objektivnímu posouzení není podle našich zkušeností (viz dále) dostačující provádět diagnostiku pomocí lupy, stereomikroskopu nebo starších typů trichinoskopů, ale nejlépe binokulárními světelnými mikroskopy se spodním osvětlením (v procházejícím světle) při 100 až 125násobném zvětšení. Zvířata mohou být totiž infikována také neopouzdřenými druhy trichinel a v takových případech je identifikace larev při použití neodpovídajícího zařízení téměř nemožná.
Trávicí metoda
Naše akreditovaná laboratoř provádí od 1. listopadu 2001 vyšetřování svaloviny zvířat v souladu se všemi nařízeními referenční, tzv. trávicí metodou s použitím elektromagnetické míchačky, platnou pro všechny státy EU. Základní princip spočívá v tom, že v přesně definovaných laboratorních podmínkách dochází působením tekutiny obsahující 25% kyselinu chlorovodíkovou, pepsin a vodovodní vodu, v odpovídajícím poměru a v závislosti na množství vyšetřované svaloviny, v případě jejího napadení k uvolňování infekčních larev trichinel. Vyšetřuje se 1 gram z každého domácího prasete a 5 gramů čisté svaloviny (bez zbytků tuku, svalových povázek apod.) divokých prasat, koní a ostatních volně žijících zvířat. Chtěli bychom lovce požádat, aby zasílali dostatečné množství svaloviny (nejméně 30 až 50 gramů). Při její přípravě k vyšetření dochází k určitým ztrátám, a pokud bychom měli nějaké podezření na pozitivitu, musí se proces opakovat tak dlouho, dokud nebude stanovena identita nakaženého zvířete. Jednotlivé kroky metody jsou dokumentovány na obr. 5 – 10.
Administrativa spojená z trichinoskopickým vyšetřováním
Na každou akreditovanou laboratoř jsou kromě odborného zvládnutí dané metodiky kladeny značně vysoké nároky také na vedení příslušné agendy. Administrativní činnost a jednotlivé úkony s ní spojené jsou časově velmi náročné a tvoří téměř polovinu pracovní doby daného laboratorního pracovníka. Práci nám často komplikují již při registraci došlých vzorků nedostatečně, neúplně a nečitelně vyplněné žádanky k vyšetření. V takových případech si musíme údaje proto ověřovat telefonicky buď přímo u lovců, nebo u pracovníků inspektorátů, abychom předešli dodatečným vysvětlováním, nepřesným údajům a následným opravám výsledných protokolů parazitologického vyšetření.
Po příjmu se nejprve každý vzorek nebo jejich soubor zaregistruje v programu LABSYSTEM (obr. 11). Po vyšetření se přiřadí výsledné hodnoty nálezů, provede se finanční kalkulace, vyhotoví se buď dodací list, nebo faktura a konečně se vystaví závěrečný protokol parazitologického vyšetření.
Stále velmi diskutovanými otázkami na pracovníky laboratoře ze strany lovců jsou platba za provedené trichinoskopické vyšetření, včasnost a způsob předání výsledků. Žádné problémy neexistují, když lovec přijde osobně, při příjmu vyplní daný formulář se všemi potřebnými údaji a platí tzv. přímou platbou (fakturace). Protokol společně s fakturou je mu zaslán podle jeho přání buď poštou, nebo si jej sám po zaplacení v den, který mu vyhovuje vyzvedne.
K určitému dohadování dochází tehdy, když lovec přinese do laboratoře vzorek a žádá vyšetření v rámci tzv. nákupu služeb (forma státní zakázky neboli vyšetření se hradí z příspěvku státu), aniž by měl žádanku stvrzenou a odsouhlasenou příslušným veterinárním lékařem daného inspektorátu. Podobná je také situace, kdy myslivci zašlou vzorek bez vědomí inspektorátu prostřednictvím našich svozných linek. Argumentují tím, že by nám mělo být známo, a my o tom dobře víme, že vyšetřování svaloviny – masa divokých prasat určené k osobní spotřebě je hrazeno ze státního rozpočtu a pro lovce je tudíž zdarma. V obou těchto případech jsme však podle doposud platných nařízení povinni vystavit fakturu za vyšetření lovci, neboť pracovníci laboratoře nemohou sami rozhodovat o tom co je a není již zmíněná státní zakázka zvláště tehdy, pokud to ze žádanky jednoznačně nevyplývá.
Doporučujeme proto odpovědným funkcionářům mysliveckých sdružení, různých honebních společností apod., aby navázali mnohem užší spolupráci v této problematice s příslušnými inspektoráty Krajských veterinárních správ. S jejich souhlasem budou provedená vyšetření hrazena z příspěvku státu a odstraní se tím mnohdy zbytečná vzájemná nedorozumění. V této souvislosti si dovolujeme uvést, že právě tato oblast vedení agendy patří mezi významné a je předmětem kontrolních orgánů, které vedení naší administrativy pozorně sledují. Pokud tedy SVS ČR nerozhodne o tom, že každý vzorek svaloviny zvířat určený k vyšetření na přítomnost Trichinella spp. bude pro zákazníka zdarma, musíme dodržovat platná nařízení i v této oblasti. Veškerá vyšetření svaloviny domácích prasat z jatek jsou hrazena státem.
Jaká je praxe předávání výsledků vyšetření?
Výsledky vyšetření svaloviny domácích prasat a divočáků ze zvěřinových závodů jsou podle dohody zasílány kompetentním osobám v jednotlivých provozech e-maily, SMS zprávami nebo faxem tentýž den odpovědným pracovníkem laboratoře večerní směny mezi 22.00 – 24.00 hod. V písemné podobě jsou orazítkované protokoly parazitologického vyšetření s podpisem ředitele ústavu nebo určeným pracovníkem včetně dodacích listů rozváženy podle rozdělovníku řidiči svozných linek a zasílány poštou.
Vzorky svaloviny divokých prasat dovezené do laboratoře od lovců se sběrných míst svoznými linkami ve večerních hodinách jsou vyšetřovány ranní směnou okamžitě následující den. Výsledky jsou v závislosti na počtu vyšetření odesílány většinou elektronicky mezi 10.00 – 16.00 hod. veterinárním lékařům nebo na inspektoráty podle údajů na žádance. Další postup je shodný se způsobem odesílání písemností jako u domácích prasat. Nejsme prozatím oprávněni sdělovat výsledky osobně lovcům v těch případech, kdy vyšetření bylo provedeno v rámci státní zakázky. Způsob předávání výsledků přímo lovcům se v současné době řeší.
Porovnání metod záchytnosti larev trichinel ve svalovině spontánně nakažených divokých prasat
Vedoucí „Národní referenční laboratoře pro parazity“ (NRL), MVDr. Jiří Harna, ze Státního veterinárního ústavu Olomouc, svolal na dny 10. - 11. 11. 2010 odborný seminář. Zúčastnili se ho zástupci parazitologických laboratoří SVÚ Olomouc, Jihlava, České Budějovice, Hradec Králové a Praha. Kromě jiného byla zvýšená pozornost věnována pozitivnímu nálezu Trichinella spp v SVÚ Olomouc z uloveného jezevce dne 15. 10. 2010 na lokalitě Mosty u Jablunkova v Moravskoslezském kraji. O tomto případu informoval na stránkách časopisu Agrospoj, 44:38-39,2010 také tiskový mluvčí SVS ČR MVDr. Josef Duben. Od našeho setkání neuplynula dlouhá doba a veřejnost byla uvedeným tiskovým mluvčím seznámena dne 17. 12. 2010 s dalším nálezem trichinel ve svalovině divokého prasete uloveného lovcem z mysliveckého sdružení v Dolní Dobrouči (okres Ústí nad Labem, Pardubický kraj). Vyšetření prováděla parazitologická laboratoř v SVÚ Jihlava vedená MVDr. Karolem Račkou a výsledek byl následně potvrzen NRL v SVÚ Olomouc. Týmž lovcem byli ve stejné lokalitě uloveni další dva kusy selat divočáků v druhé polovině ledna 2011. U prvního detekovala larvy trichinel opět laboratoř v SVÚ Jihlava, u druhého NRL v Olomouci, která nález z Jihlavy rovněž potvrdila. Z těchto informací vyplývá, že v dané lokalitě může být přírodní „mikroohnisko“ Trichinella spp. a detailněji tyto případy popisují Koudela a kol.(2011).
Na tomto místě pokládáme za milou povinnost poděkovat MVDr. Jiřímu Harnovi (SVÚ Olomouc) a MVDr. Karolu Račkovi (SVÚ Jihlava) za poskytnutí pozitivních vzorků svaloviny od všech tří selat prasete divokého. Bylo to i v souladu se závěry zmíněného semináře parazitologů, ve kterých jsme konstatovali, že v případě nálezu trichinel bude svalovina předána všem ostatním laboratořím SVÚ zajišťujících diagnostiku tohoto parazita. Materiál tedy posloužil k vlastnímu „proškolení“ všech našich pracovníků laboratoře.
Různé typy svaloviny (označené u prasete č. 1 lovcem), jsme dále využili k porovnání záchytnosti larev trichinel tradiční kompresní a trávicí metodou. Vedly nás k tomu některé literární údaje, naznačující, že u druhů trichinel (např. Trichinella pseudospiralis), které netvoří v konečné fázi svého vývoje ve svalovině pouzdra (cysty), je detekce přítomnosti infekčních larev pomocí komprese buď velmi obtížná, nebo zcela nemožná. Výše uvedeným autorům, jak je zřejmé z textu publikace, se tímto způsobem detekovat larvy nepodařilo u žádného ze tří pozitivních prasat. V naší laboratoři jsme však zaznamenali určité podezření na přítomnost neopouzdřené larvy při vyšetřování svaloviny označené lovcem „guláš“ (prase č. 1, obr. 12). Byl to významný podnět pokusit se tedy prokázat pozitivitu s definitivní platností při této metodě u všech tří spontánně nakažených divokých prasat z lokality Dolní Dobrouč. Vyzkoušeli jsme proto různé diferenciální metody vitálních barvení svaloviny, ale bezúspěšně. Prozatím jsme nakonec dospěli k nejjednoduššímu způsobu, který by na základě zkušeností s diagnostikou a mikroskopováním umožňoval identifikovat larvy neopouzdřených druhů trichinel (obr. 13), mezi které s největší pravděpodobností patří i nedávné popsané nálezy u selat divokých prasat na Orlickoústecku.
Postup modifikované kompresní metody je následující:
1. Odvážíme 1 gram čisté svaloviny.
2. Pomocí skalpelu provádíme seškraby, které postupně přenášíme do jednotlivých 28 políček kompresoria.
3. Na každý vzorek v políčku nakapeme pomocí pipety glycerin a necháme 5 – 10 minut působit.
4. Po uvedené době přiložíme horní skleněnou desku kompresoria a pomocí utahovacích šroubů vyšetřovanou svalovinu stlačíme.
5. Kompresorium zbavíme zbytků vytékajícího glycerinu a obě skleněné desky důkladně vyčistíme tak, aby nebyly matné.
6. Jednotlivá políčka prohlížíme v procházejícím světle optickým binokulárním mikroskopem při 100 až 125násobném zvětšení.
Základním principem této modifikované kompresní metody je tedy připravit nejprve velmi tenký vzorek svaloviny k mikroskopickému vyšetření, což ani jeho důkladné stlačení o velikosti pšeničného či ovesného zrna pomocí šroubů mezi skla kompresoria neumožňuje. Dále působením glycerinu s vysokým obsahem lomu (1,456) dochází k výraznému prosvětlení svaloviny, čímž je do určité míry možnost detekce přítomných larev trichinel usnadněna. K diferenciální diagnostice přispívá také použití vhodných filtrů, které mohou zvýšit kontrast a tím zvýraznit pozorovaný objekt v prohlíženém preparátu (obr. 14 - 16).
V tabulce 2 uvádíme výsledky vyšetřování různých typů svaloviny od tří spontánně nakažených divokých prasat třemi různými způsoby. Z ní vyplývá, že při použití tradiční kompresní metody, kromě jediného podezřelého nálezu (obr. 12), se nám nepodařilo přítomnost larev prokázat v žádném vzorku přesto, že byly zaručeně pozitivní (viz výsledek vyšetření trávicí metodou). Z tabulky je dále zřejmé, že námi modifikovanou kompresní metodou bylo možné označit vzorek jako pozitivní tehdy, jestliže v 5 gramech svaloviny vyšetřované referenční trávicí metodou bylo zjištěno více než 5 larev, což je v přepočtu jedna v 1 gramu. Pokud jsme v 5 g svaloviny detekovali tímto způsobem19 - 27 larev (průměr v 1 g činil 3,8 - 5,4) prokázali jsme navrhovaným postupem přípravy svaloviny k vyšetření opakovaně dokonce 1 – 3 larvy ve 28 políčcích kompresoria. Kromě larev trichinel lze takto poměrně snadno diagnostikovat i mikrocyty kokcidií rodu Sarcocystis (obr. 17), což je při standardní kompresní metodě velmi obtížné. Tímto prvokem byla infikována všechna tři divoká prasata.
Závěr
Na základě zjištění získaných z porovnávání dvou základních diagnostických metod při vyšetřování svaloviny tří spontánně nakažených divokých prasat Trichinella spp. z Orlickoústecka jednoznačně vyplynulo, že nelze k rutinní diagnostice doporučit tradiční kompresní metodu. Přesto, že byl vyšetřován zaručeně pozitivní materiál, byly výsledky opakovaně falešně negativní. Na rozdíl od údajů Koudely a kol. (2011) se nám však i u těchto zvířat podařilo prokázat larvy novým popsaným způsobem založeném na přípravě vzorků svaloviny k vlastnímu vyšetření v kompresoriu. Nejlepší výsledky byly při této modifikaci dosaženy tehdy, jestliže bylo v 5 gramech svaloviny vyšetřované trávicí metodou v jednom gramu průměrně 3,8 - 5,4 larev. Pozitivní byl nález ještě při průměrném počtu 1 - 1,4 larvy/gram. Ve všech ostatních případech byly rovněž dosahovány falešně negativní výsledky. Z těchto zjištění lze proto trávicí metodu, závaznou také pro všechny ostatní země EU, považovat v současné době skutečně za nejvhodnější a nejobjektivnější diagnostickou metodu. Mnohé studie stále intenzivněji naznačují možnosti využití sérodiagnostiky i imunologických metod založených na principu nepřímého ELISA testu k diagnostice Trichinella spp., které by v budoucnu mohly nahradit i trávicí metodu, která vytlačila tradiční kompresní.
Autor příspěvku vyjadřuje upřímné poděkování Bc.Daniele Pejchové za technickou asistenci při zpracovávání fotodokumentace.
Ing. Ivan PAVLÁSEK, DrSc.
Státní veterinární ústav, Praha